中央红军主力长征后，他任瑞（金）会（昌）县游击司令部参谋长，在长汀、瑞金、会昌交界的武夷山区坚持了极其艰苦的3年游击战争。1937年春任汀瑞游击支队参谋长，继续在闽赣边坚持游击战争。
1937年抗战爆发后，周桂生奉命奔赴皖南抗日前线。到达安徽太平以后，新四军4个支队胜利会师。他从1938年起任新四军第2支队副团长、团长，皖南第2纵队司令员。在抗日前线，他身先士卒，经历了无数次战斗，多次率部痛击日伪军。
1940年12月底，新四军老三团、新三团奉命合编为新四军第二支队，周桂生任司令员。1941年1月，国民党顽固派制造皖南事变，新四军皖南部队遭到包围，新四军决定，除军直机关部队外，编成3个纵队，周桂生任第二纵队司令员，率第二纵队为中央纵队，掩护军直属队及教导总队突围。
为了保护军首长的安全，周桂生亲临前沿阵地指挥作战。13日黄昏，率部转移至狮形山西北高地时，遭遇敌人重兵围攻。激战中，周桂生身上多处中弹，仍端枪冲向敌人，掩护战友突围，最终壮烈牺牲，时年35岁。
