到了19世纪90年代，好几种细菌被识别并确定它们与某些疾病和传染病相关，还找到了消灭它们或者至少控制其传播的新方法，并引进到医院和外科手术中。但是还有一些疾病依旧难以解释，似乎更难对付。狂犬病就是其中之一。巴斯德推测，也许与之有关的生物体小到这样的程度，即使通过显微镜也难以看到。（后来的研究证明了巴斯德的推测：病毒也是疾病成因。）
巴斯德曾有三个子女死于传染病（伤寒），这让他痛苦不已，此事激发了他去研究治愈各种致命传染病的方法。后来他发现狂犬病是死亡率是最高的，为了挑战这一难题，巴斯德开始着手研究对付狂犬病的方法。
巴斯德在研制狂犬疫苗
巴斯德认为传染病的微生物在特殊的培养之下可以减轻毒力，变成防病的疫苗。因此他大胆地从一位五岁狂犬病患者身上采集唾液稀释后注射到兔子体内，兔子相继发病死去。巴斯德又接着采集这些死兔的唾液稀释后继续注射到其他健康兔子体内，毫无例外这些兔子也都死掉了。如此重复试验100多次后，巴斯德怀疑这种人畜共患的疾病是作用于神经系统的。于是他打开病兔子的脑壳，提取病原菌并进行培养，稀释成不同浓度继续给兔子试验。
直到将“毒性最弱的病菌液”注射于狗，这只狗在28天后恢复正常。隔一段时间后，又给这只狗注射“毒性最强的病菌液”，这只狗成功地活了下来。巴斯德推论出狂犬病病毒应该都集中于神经系统，因此他大胆地从病死的兔子身上取出一小段脊髓，悬挂在一支无菌烧瓶中，使其“干燥”。将干燥后的脊髓和蒸馏水混合注入狗的身上，狗都神奇的活了下来。（我们今天已经知道，这是一种减毒活疫苗）
巴斯德用兔子做实验
这只狗的存活坚定了巴斯德疫苗研制的信念。他相信这种从病死免身上抽出脊髓、放入完全消毒的瓶中干燥、14天后取出并研碎加水制成的疫苗可以用在人体上。1885年7月6日，感染狂犬病的男孩约瑟夫（Joseph Meister）的出现，不仅是约瑟夫生的希望的开始，更是巴斯德实验成功的开始。
1885年7月6日，巴斯德发明的狂犬疫苗首次使用，他亲手为9岁的约瑟夫接种狂犬疫苗
