最大的疑问在于谁是凶手，特别是谁是幕后主使。当被认为凶手的李·哈维·奥斯瓦尔德被逮捕时，他不停高喊：“我没杀肯尼迪总统！我没有杀害任何人！我什么都不知道！”
报道称，到底是什么原因让奥斯瓦尔德朝着时年46岁的肯尼迪开枪，坊间出现了多种阴谋论。甚至有人认为这是一起规模庞大的阴谋，中央情报局、克格勃和联邦调查局，乃至时任副总统林登·约翰逊都被怀疑卷入其中。
更令人生疑的是，嫌犯奥斯瓦尔德在两天之后被另一个神秘人物杰克·鲁比枪杀，而鲁比在4年后也离奇死亡了。据说鲁比杀死奥斯瓦尔德是为了灭口，好让世人永远不知道幕后主使是谁。虽然这两个人已经无法再作任何解释，但有关肯尼迪死因的谜团并没有随着时间流逝而被人们遗忘。
报道称，还有人怀疑黑帮卷入了这场刺杀阴谋。早有坊间传言称，肯尼迪本人当初就是在黑帮的助推之下才当上总统的。美国导演奥利弗·斯通在电影《刺杀肯尼迪》当中就大胆提出了黑帮论的假设。在影片当中，刺杀总统的行动是中情局和军方情报部门联合黑帮的杰作，而奥斯瓦尔德只是一只替罪羔羊。
