２０世纪８０年代初，工作于欧洲分子生物学实验室的雅克·杜博歇提出了“急速冷却”方案，奠定了低温冷冻电子显微术样本制备与观察的基本技术手段。冷冻可以对样本起到保护作用，但通常的冷冻过程中，样本里的水会结成冰晶，可能使物质结构发生改变。更重要的是，冰晶会“喧宾夺主”，使电子发生强烈衍射，干扰观测。杜博歇用液氮对生物大分子溶液薄膜进行瞬间冷冻，使水来不及结晶而是形成无定形的“玻璃态”，就不会产生衍射。

电子显微镜观测的样本通常是只含一层分子的薄膜，可以视为二维的。对大量散布的同一种分子拍摄二维图像，再把这些图像整合起来，就可以得到该分子的三维图像。２０世纪７０年代，在纽约沃兹沃思研究中心工作的约阿希姆·弗兰克开始进行这种“三维重构”的理论研究，开发出了多种数学工具和图像处理方法。

１９９０年，英国剑桥分子生物学实验室的理查德·亨德森小组报告了他们对一种色素蛋白进行的三维重构，这项成果是低温冷冻电子显微术的重要里程碑，证明“冷冻样本－二维成像－三维重构”的确可以得到高分辨率的三维图像。它标志着一种研究生物大分子结构的新方法已经成形，其思路与Ｘ射线晶体学迥异，可以给生物体内溶液中、处于工作状态的分子“抓拍”快照。

不过此后相当长时间里，低温冷冻电子显微术的精度都不太高，无法与Ｘ射线晶体学相比。这里既有观测手段的原因，也有计算机发展水平的限制。

近几年来，传统的电子显微术照相机被可以直接检测电子的设备取代，解决了图像转换导致细节丢失的问题，这个重大进展也是亨德森的贡献。辅以新的高分辨率图像处理算法，以及突飞猛进的计算机运算能力，低温冷冻电子显微术的“高清时代”终于来临，例如２０１６年发布的谷氨酸脱氢酶结构，分辨率达到了１．８埃（１埃等于１０的负１０次方米）。

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