图注：在实验室内培育人类胚胎。（图/托比·利）
出品|网易科学人栏目组翟中超
2013年年中的两个星期，发育生物学家玛格达莱纳·泽尼卡-格茨（Magdalena Zernicka-Goetz ）非常忙碌，因为她正在追逐一个世界纪录。泽尼卡-格茨和她在英国剑桥大学的同事正试图在实验室培育人类胚胎，而他们要培育的胚胎比以往任何时候都要长！泽尼卡-格茨他们想要更深地了解一团微小的细胞是如何将自身转变成一个复杂的多部分结构。在研究开始的一星期后，研究团队不得不考虑终止胚胎发育，泽尼卡-格茨很清楚，在人类胚胎发育这个大问题上，除了研究本身，我们还有很多东西要处理，比如说伦理。
有些女性捐献过卵细胞，而现在她们不需要再进行体外受精了，研究人员就用这些卵细胞展开胚胎研究。研究小组将细胞浸泡在一种特殊的培养基中，并将其安置在保温箱中，这和之前研究小鼠胚胎的方法是一样的。因为样本必须放在严格控制的环境中，所以科学家每天只能将这些样本取出一两次，以在显微镜下追踪进展。
日子一天天过去，6天、7天，到了第8天，胚胎仍在继续茁壮成长。“我们都屏住了呼吸，”泽尼卡-格茨回忆道。“一天天变得越来越激动人心。”这支团队将试验进行了12天，这是最长的一次，最终他们进行了13天。“这真是难以置信，我对此很兴奋，”泽尼卡-格茨说道。
泽尼卡-格茨团队取得的进步，以及纽约的一个研究团队所做的类似壮举，是过去5年里此领域为数不多的几项成就之一，他们都致力于促进早期人类发展的研究。研究人员对人类胚胎的接触一直有限，而且他们对人类胚胎的早期转变知之甚少。但现在，细胞培养方法的改进使研究人员在体外培养人类胚胎的时间增长至两周。科学家利用基因编辑技术，如CRISPR技术，来构建人造胚状结构，以探索形成胚胎的细胞信号和物理作用力（也可理解为环境因素），因为后两者对塑造胚胎及胚胎的支撑组织起到重要作用。
这些技术在早期主要流程中很重要，比如说着床，着床就是胚胎在很小时将自己嵌到子宫壁上，而到了这个阶段，科研人员也就没法直接对胚胎的进展进行研究了。新的高分辨率数字图像技术这是就用上场了，这种技术可以很好地揭示胚胎肌肉和神经在未来几周后的发育过程。研究这些，我们就能更好地理解先天缺陷和发育障碍是如何产生的，还能了解为什么有些怀孕会失败。
新技术帮了大忙，但同时也将研究人员推向了未知的伦理领域。从20世纪70年代末开始，伦理学家和科学家就“14天法则”达成了一致。也就是说，对人类胚胎的研究限制在受精后的两周内，因为两周时胚胎就可能第一次表现出有神经系统的迹象，这也是胚胎分裂的前兆。直到如今，国际公认的14谈法则一直是一个纯粹的假设限制，因为我们是根据对除人外的其他动物的研究来定的时间红线。“并不是每个人都认可这个法则，而且现在在技术上可以突破这一法则。”纽约加里森黑斯廷斯中心的生物伦理学家约瑟芬·约翰斯顿（Josephine Johnston）说道。
胚胎操作指南
整个动物界，许多早期发育过程都有着惊人的相似性，每个物种都会在这一阶段调整基因或细胞信号。在哺乳动物中，科学家研究最多的是小鼠的胚胎，他们会将每个基因挨个禁用，以测试每个基因的作用。研究小鼠以获得数据相对容易，而且小鼠也被认为是研究人类胚胎发育的良好指标，因为小鼠和人的许多早期细胞类型和成分比较相似。但研究人员现在开始质疑这种相似之间的差异究竟有多大。“我们多少已经能够探索一点人类早期的发展的情况，但有一点很明显，老鼠和人类胚胎相似，但相似并非一模一样，”加拿大多伦多儿童医院的发育生物学家珍妮特·罗森特（Janet Rossant）说道。
图注：人类胚胎分裂过程图示。几十年来，由于技术有限，研究人员只能利用动物实验或对组织样本的研究来揣测人类胚胎发育的早期过程。现在技术发展了，科学家能在实验室内培育人类胚胎，还能利用人类干细胞培养胚状结构。科学家利用基因编辑技术阻断了人类胚胎早期发育阶段中一个重要的蛋白质，这个蛋白叫Oct4，Oct4一被阻断，胚胎就无法发育成200细胞囊胚。为什么要提Oct4呢？这回答了上文的疑问，因为小鼠胚胎发育后期Oct4活动就不明显，这就是人和小鼠在胚胎发育早期阶段的不同点之一。正是这些小进步、小发现，科学家才能逐渐打开人类早期胚胎发展的黑匣子。（图/诺拉·福格蒂；凯西·尼亚坎）
可用于试验的人体组织比较有限，于是科学家开始利用高效的基因编辑技术，比如说CRISPR–Cas9，来探索胚胎发育的早期阶段。到目前为止，只有少数几个研究团体获得了开展此类研究的授权，部分原因大家都能猜到，因为胚胎基因改造具在伦理上比较敏感。
在伦敦弗朗西斯·克里克研究所，发育生物学家凯西·尼亚坎（Kathy Niakan）领导着此领域第一个获得国家监管结构批准的研究项目。2017年，凯西的团队报告称，他们使用CRISPR–Cas9技术来编辑人类和小鼠胚胎干细胞中的一个基因表达，就是把上文中提到的Oct4蛋白质去掉。去掉之后，人类早期胚胎成不了囊胚了，而小鼠的却能形成囊胚，但后期发育也会接近停滞。
科学界有一种观点受到越来越多的支持，即，在非常早期的发展中，某些基因细节，如某些基因的活跃性可能只针对人类有用，上面提到的人和小鼠的对比试验就是例子。“大多数体外受精胚胎无法发育到囊胚阶段，但目前尚不清楚原因，搞清楚哪一步会决定或影响胚胎中第一个细胞类型将有利于我们改善体外受精成功率。”尼亚坎说道。在未来的工作中，尼亚坎希望研究人类哪些基因会使一小部分囊胚细胞继续发育成更成熟的胚胎。
何处是我家
在形成一个有着200细胞的小球后，小囊胚必须嵌入子宫壁才能存活，这一过程大概在受精后第七天进行。但是一旦囊胚嵌到子宫壁上，科学家也就在很大程度上无法继续研究接下来的发展情况。观察着床过程本身就是第一个挑战，在最近之前，研究人员一直缺乏可靠的方法来维持胚胎发育超过第一周。
现在，科学家打开了第一个挑战的黑匣子。在2016年5月发表的两篇论文中，泽尼卡-格茨团队和纽约洛克菲勒大学阿里·布里瓦卢团队报告了第一例能够将人类胚胎培育12至13天的培养系统。研究人员发现，有了正确的生长因子和营养成分，培养基中的人类胚胎就能“植入”到培养皿底部的表面上。值得注意的是，胚胎不需要任何母体组织来触发“植入”后的早期重构步骤。“我对此感到很震惊，”布里瓦卢回忆道。“我本以为在实验室中胚胎进行这种附着后活不了一两天。”
实验中，胚胎附着的培养皿要比真正的子宫壁平整的多，这是和实际情况不同点之一。但即便如此，人工培养的胚胎还是创造了几个里程碑，而此前，我们只能利用动物实验，或者用流产后收集的人类组织样本进行有限的研究。在最新的实验中，
当胚胎附着在培养皿上后，外部细胞层开始分化为早期的胎盘以及其他细胞类型以支持胚胎的成长。在内部，细胞似乎发展成胚胎的前体和卵黄囊，而卵黄囊是为胚胎提供血液的早期结构。大概两周后，两个研究小组按照14天法则都结束了试验。
试验结束了，一些胚胎的发育过程也就结束了。但研究人员表示，如果下一次进行进一步优化，这些培养系统就可以帮助我们发现胚胎头两周发育的更多细节。
图注：即使不植入子宫，胚胎也能自我组织。图片上半部分，体外培养胚胎中的细胞开始分化成多种细胞类型，其中紫色部分将变成更成熟的胚胎，而羊膜腔也在形成，羊膜腔将围绕着胚胎而成长。在动物当中，从第15天开始，从头到尾的身体中轴以及神经系统开始出现。但有科学家对人类干细胞培养出的胚胎进行研究发现了不同的结果，他们对14天法则提出了不同的意见。（图/玛格达莱纳·泽尼卡-格茨团队；尼克·斯藩塞）
在第三周，也就是原肠胚形成的过程中，会发生几个关键事件。胚胎开始形成一个身体中轴，而轴的一端注定会发育成头部。所有的细胞开始迁移并分化成三层，这将最终形成人体所有的器官和组织。这个过程太重要了，因此这也是履行14天法则的主要原因。
一些研究人员正在寻找替代方法，他们利用人类干细胞技术构建合成胚状结构，这种情况就不用遵循14天法则了。这类构建缺少全面发展的某些至关重要的组件，因此，即使被植入子宫，也发育不成胎儿。2014年，布里瓦卢、埃里克·西贾和他们在洛克菲勒大学的同事发布报告称，他们利用专门培养的人类胚胎干细胞在体外模拟了原肠胚形成的过程。他们发现，当干细胞被限制在几百微米的范围内生长时，这些干细胞就能分化成一种外形看起来像牛眼的细胞，而这种牛眼一样的细胞又包含着能发育成身体所有部分的三种主要细胞类型。从扁形虫到灵长类，几乎在所有的动物中，这些细胞类型都具有类似的作用：中心的细胞变成皮肤、大脑和神经系统，中间层细胞变成肌肉、血液、骨骼和各种器官，最外层的细胞会变成消化系统和呼吸系统。
这类构建的胚状结构看起来比较扁，而真正的人类胚胎的构造则比较立体，尽管有差异，但在细胞和分子水平上，研究人员原本就期望获得这种效果。“利用一个系统，我们能分析信号通路和细胞命运之间的关系，”西贾实验室前博士后研究员阿里耶·瓦姆弗莱士（Aryeh Warmflash）说道。
图注：胚状体内的一波又一波信号，红色和黄色信号更强，蓝色信号稍弱，这种信号强弱的差异促使了细胞的分化。（图/易德塞·海姆斯凯克；阿里耶·瓦姆弗莱士/美国莱斯大学）
对该系统的后续研究已经揭示了胚胎细胞如何利用几何结构和化学过程来自我组织成不同的组织类型。2016年，布里瓦卢、西贾和他们的团队演示了干细胞可以感知自己在圆形集落中的位置的过程，因此，调整它们对生长因子分子的反应就能帮助形成细胞离散区域。2017年，莱斯大学瓦姆弗莱士团队在《bioRxiv》网站预印本系统上发布的一篇报告展示了生长因子的动力学在胚胎发育中起着一定的作用。研究人员发现，一组特定的蛋白质释放出激增的信号，统称为Nodal信号通路，这波信号像波浪一样从集落圆周向内扩散，在其扩散初期留下不同的细胞类型。
布里瓦卢团队研对这个系统的研究更加深入，他们在今年5月7日展示了用生长因子的组合来处理这些类型的集群就能诱导“组织者”细胞的形成，而“组织者”细胞，顾名思义，就是未来组织各类型细胞出现及发育的原始者。除人外的其他动物中，这些特殊的细胞能引导周围的细胞形成一个有头有尾的中轴。但是，由于14天法则的原因，科学家从未见过人类组织者细胞的的运转过程。考虑到人类胚胎工作面临的伦理限制和技术局限，布里瓦卢取而代之将假定的人类组织者细胞移植到发育中的鸡胚上，然后观察到被移植的细胞指导小鸡细胞发展出第二个鸡神经系统。
胚胎的支持结构
关于人类早期发展的主题，很多研究都集中在胚胎本身上，但很多其他的组织对胚胎的生存也有至关重要的影响，其中就包括羊膜囊和胎盘，羊膜囊是胚胎的住所，而胎盘则能为胚胎提供氧气和营养。
为了更好地研究羊膜囊是如何发育的，研究人员用人类干细胞制造了一个模型。去年，发育生物学家黛博拉·古穆西奥（Deborah Gumucio）、密歇根大学生物工程师傅建平以及他们的同事发现当在凝胶器皿上培养人类干细胞并用天然的支架分子包围这些干细胞时，这些细胞就自我组织成一个类似于羊膜囊的东西。大约24小时后，类羊膜囊上就出现一个口，然后，细胞开始在一侧变平，而另一侧的细胞就开始拉长，而这正是原肠胚形成前的典型过程。
这个人造模型只复制了胚胎的核心和囊，没有其他的支撑组织，而后者是胚胎存活生长的必要条件。尽管缺少支撑组织，研究人员仍能识别出一些可能帮助产生这种不对称结构的分子信号。“就这种人造模型试验，就现在进行的阶段，我们仍有好多重要信息有待发现，所以我们没理由将其发育成更晚的胚胎，”古穆西奥说道。科学家将这种胚状结构培养物保持了5天，对应到真实人类胚胎发育期大概是9到14天，虽然和真实胚胎有差异，但研究人员仍是依据14天法则，在对应的第5天停止了培养。
泽尼卡·格茨团队正尝试开发更完整的结构。2017年，格茨团将两种类型的小鼠干细胞组合起来进行培养：一种形成胚胎本身，一种有助于形成胎盘，后者称为滋养层干细胞。研究人员将培养物嵌在三维支架上，这种合成结构就像是胚胎着床后的环境。现在，研究人员正致力于用人类干细胞创造出一种类似的胚状结构。科学家可以借此更好地了解胚胎组织和胚胎外组织的相互作用，比如说胚胎和胎盘。
随着一些实验室开发出这些越来越复杂的合成模型，即所谓的胚胎，伦理问题正在日益凸显。“我认为这是一个灰色地带，”位于缅因州巴尔港的杰克逊实验室的干细胞生物学家马丁·佩拉（Martin Pera）说道。“我们应该如何看待这些正在发育的结构？”许多伦理学家和科学家都认为，目前进行的合成胚状体比较简单，因此不必一定遵守14法则。但是位于俄亥俄州克利夫兰的凯斯西储大学的生物伦理学家玄仁洙（Insoo Hyun）表示，“给胚状体的特点下定义本身就是一项挑战，比如说我们很难确定胚状体发育到什么程度或是出现何种特点才算是更加接近真实的胚胎。很难把握这个度，现在培养的胚状体可能已经超越了14天法则，比如说，你把它移植到子宫，它就能发育成更复杂的形态。”
数据重整
研究人员在研究后期阶段的解锁细节方面也取得了一些进展，组织染色和成像技术功不可没。在2016年《科学》（Science）上发表的一篇报告中，阿姆斯特丹大学医学中心的研究人员将华盛顿卡内基科学研究所保存的15000个组织切片进行数字化。这些组织切片是19世纪80年代到20世纪前半期期间从流产、手术和尸体解剖中获得的样本。荷兰的一项研究时间跨度超过了两个月，研究人员用数字技术追踪了单个切片上多达150个器官的轮廓，然后对截面进行调整对齐重新构建了原始胚胎的三维模型，这个三维模型可以当做活性数据集。
在高分辨率下研究胚胎已经有了一些发现，比如说，在胚胎学角度上看，肾脏的出现及发育要经历三个连续的阶段，先后是前肾、中肾和后肾，以前科学界都认为肾脏出现和发育的过程是从上往下发生的，后来有研究小组根据更新的技术发现，因为肾脏的生长速度和椎骨生长速度并不一样，所以肾脏的出现及发育的过程并不是单向的向下，而是上上下下的起伏式发育。
但是卡内基研究院收集的切片有个主要局限，就是缺少分子标记，这就使研究人员不容易区分出不同的细胞类型。为了克服这些问题，位于巴黎的法国国家健康与医学研究所的阿兰·切多尔（Alain Chédotal）在2017年发表了一份新的三维数据集。新的数据集包含36个胚胎和胎儿，这些胚胎和胎儿样本处在6到14星期的发育阶段。阿兰和其团队对捐赠的样本进行组织清理处理，这样就能使样本更容易在显微镜下成像，然后又进行着色以突出不同的细胞类型。
图注：随着神经的发展，左右手也有着不同的分支模式。（图/阿兰·切多尔；摩根·贝勒）
根据新的三维图像，研究人员能在高分辨率细节上观察神经、肌肉、肺和其他器官的发育过程。“就细节而言，这是前所未有的成果，”位于华盛顿的霍华德大学医学院鲁伊·迪奥戈（Rui Diogo）说道。迪奥戈对数据集进行了挖掘，了解到肢体肌肉的发展情况。
迪奥戈研究小组观察到手部和足部的一些肌肉会在发育过程中出现消失或融合，这些研究结果尚未发表。“当我们还是胚胎时，我们的肌肉和成年后的肌肉很不一样，”迪奥戈说道。此外，还有其他一些意想不到的发现，比如切多尔报告称，尽管左右手神经组织具有相似性，但在第7到11星期内，每只手的细的分支模式会沿着不同的路径进行发散伸展。
法则的去留
随着科学技术的改进，研究人员希望对人类早期发展有更多更深的了解，他们还希望阐明导致妊娠丢失和出生缺陷的原因。
研究人员对胚胎早期发育的研究日益清晰，这也使伦理问题越发凸显。也有一些人认为，随着泽尼卡-格茨和布里瓦卢的拓展型实验的进行，科学界和伦理学界应该重新审视14天法则。今年5月，莱斯大学贝克研究所健康与生物科学中心举行了一次会议，有30位美国科学家、伦理学家和其他专家参与了这次讨论，布里瓦卢和约翰斯顿也参加了，他们讨论了是否应该打破14天法则，以及打破后应该如何设置新的界限。“我认为最好还是遵守14天法则，如有特殊情况，可通过请愿书来破例，”与会的玄仁洙说道。
随着研究结果的不断积累，技术上的进步激起了科学家的兴趣，同时也加剧了他们的不安。“这是种惊奇而又敬畏的感觉，我们正在触及人类早期的秘密，因此很多人在道德上与伦理上产生了疑虑，”约翰斯顿说道。“这些疑虑是很好的提醒，即我们在培养皿中研究的东西绝非几个细胞那么简单！”
